Использование обнаруженного цитоскелетного механизма взаимодействия дофамина с нейронами в разработке подхода
Скачать 138.51 Kb.
|
ISBN 978-5-7262-1375-0. НЕЙРОИНФОРМАТИКА – 2011. Часть 1 Е.Ю. ПАРНЫШКОВА, Е.Н. БЕЗГИНА, Л.Л. ПАВЛИК, В.П. ЛАВРОВСКАЯ, Д.А. МОШКОВ Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино scroll_live@rambler.ru Использование обнаруженного цитоскелетного механизма взаимодействия дофамина с нейронами в разработке подхода к онкотерапии* Впервые изучено действие дофамина на выживаемость, гистологию и ультраструктуру культивируемых опухолевых клеток линии HEp-2 в течение 1–3 суток. Показано, что дофамин при концентрации 10–3 M вызывает быструю гибель клеток, а от 1,0х10–4 до 5,0х10–4 M прогрессивно снижает жизнеспособность клеток и повреждает морфологию за счет индукции в цитозоле сети актиновых нитей, вызывающих слияние и лизис клеток. Предполагается, что дофамин может служить инструментом для исследования роли актина в клетках и терапевтическим средством. Ключевые слова: раковые клетки HEp-2, выживаемость, гистология, ультраструктура, взаимодействие с дофамином, актин Введение Общепринято, что, одновременно являясь гормоном и нейротрансмиттером, дофамин регулирует функции многих органов, в том числе мозга, опосредовано, влияя на морфофункциональный статус клеток через специфические мембранные pецептоpы [1, 2]. Недавно нашими исследованиями по взаимодействию дофамина с маутнеровскими нейронами золотой рыбки установлено, что этот катехоламин может прямо влиять на активность или жизнеспособность клеток, взаимодействуя с цитоплазматическим субстратом, который служит мишенью для дофамина, а именно с глобулярным актином цитозоля (Г-актином) [3, 4]. Аппликации дофамина на маутнеровские нейроны вызывали усиление функциональной активности, сопряженное с гипертрофией деcмоcомоподобныx контактов (ДПК), cфоpмиpованныx из фибpилляpного актина (Ф-актина). На этот морфофункциональный эффект дофамина дофаминовые рецепторы существенного влияния не оказывали, о чем свидетельствовали отрицательные результаты экспериментов по их блокаде. Обнаружение факта полимеризации цитозольного Г-актина при внеклеточном расположении дофамина дал основание предположить, что нейротрансмиттер проникает внутрь клетки через плазматическую мембрану. Действительно, гидрофильные молекулы дофамина способны проходить через гидрофобную сердцевину мембраны, что было нами экспериментально показано на модельных системах – плоской билипидной мембране и липосомах [5]. В опытах in vitro была также выявлена способность дофамина полимеризовать Г-актин [3, 4, 6]. Дальнейшими исследованиями было определено, что дофамин может проникать и взаимодействовать c актином цитозоля не только нейронов, но также других живых клеток, в частности, трансформированных фибробластоподобных клеток BHK-21, более адекватного объекта для исследований механизмов взаимодействия с дофамином, чем нейроны in situ [7]. Использование этих клеток позволило выявить ранее недоступные для наблюдения на нейpонаx детали взаимодействия. Так, с помощью электронной микpоcкопии, цитохимической реакции Фалька и метода высокоэффективной жидкостной xpоматогpафии было показано, что дофамин повреждает фибpоблаcтоподобные клетки за cчет избыточной и беcпоpядочной полимеризации цитозольного актина [8–10]. Анализ состава Ф-актиновых филаментов, сформированных при взаимодействии Г-актина c дофамином in vitro, показал, что молекулы дофамина встроены в нити, являются их интегральным компонентом. Постановка задачи Все выше приведенные данные по обнаружению механизма прямой полимеризации цитозольного Г-актина, служащего клеточной мишенью для дофамина, и негативные последствия, которые он оказывает на живые клетки в виде снижения жизнеспособности и морфологически наблюдаемых повреждений клеток, побудили нас дальше исследовать этот вопрос в медико-биологическом аспекте. Особенно существенной представлялась задача использовать дофамин в качестве проникающего химического молекулярного инструмента прямого действия. Предполагалось, что он поможет экспериментально воздействовать на актиновый цитоскелет, изменять морфофункциональное состояние клеток, создавая предпосылку для исследования роль актинового компонента цитозоля в функциональных проявлениях клеток. Наиболее актуальным объектом таких исследований мы считаем раковые клетки, известные повреждения актинового цитоскелета которых и сильное увеличение содержания Г-актина в цитозоле в ущерб Ф-актину являются одной из причин их метастазирования [11]. Исследований в этом направлении ранее не проводилось. Это явилось целью нашей работы. Материалы и методы В работе исследовали клетки HEp-2, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург). Клетки культивировали в 5 мл чашках Петри при 37 ˚C и 5 % CO2 в среде, содержащей RPMI-1640 и DMEM в соотношении 1:1 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина (80 мкг/мл). Чтобы исключить побочный эффект окисления дофамина (Orion, Pharma, Финляндия) в культуральную среду добавляли антиоксидант – метабисульфит натрия (200 мкМ) [12]. При этом конечные концентрации дофамина были 1,0х10–3 и 1,0х10–4 M, а также 1,5х10–4 M, 1,6х10–4 M, 2,0х10–4 M, 5,0х 10–4 M и 5,0х10–3 M. Последние концентрации использовали для выявления динамики зависимости структурных изменений от концентрации. Дофамин вносили в клеточную суспензию одновременно с посевом (до распластывания клеток на дне чашки). Выживаемость клеток оценивали в основном через 3 суток после посева по ранее описанной методике [8]. В отдельных случаях культуры изучали через 23 и 29 часов, а также через двое суток после посева, опять же для прослеживания за динамикой состояния клеток. Для микроскопии препараты фиксировали и обрабатывали по одной из двух методик, применяемых в электронной микроскопии и принятых в нашей лаборатории. В одних случаях фиксаторы (как альдегиды, так и осмиевую кислоту) разводили на какодилатном буфере, при этом использовали смесь глутаральдегида и параформа (формальдегида), в других случаях фиксаторы готовили на среде культивирования и параформ не применяли [13]. Препараты заливали в эпоксидную смолу Эпон-812 в тех же сосудах, в которых проводили культивирование. Клетки изучали непосредственно в залитом монослое в световом микроскопе NU-2E (Carl Zeiss), снабженном цифровым фотоаппаратом Nikon CoolPix 995, и в электронном микроскопе Tesla BS-500 после их ультратонкой резки с помощью ультратома EM UC6 (Leica). Результаты исследований Наблюдения за состоянием культуры HEp-2 в разные сроки инкубации в контрольных условиях, а также в присутствии разных концентраций дофамина в среде выявили такие же закономерные изменения, как и в случае клеток BHK-21, результаты работы с которыми опубликованы недавно [8]. Вкратце, установлено, что раковые клетки HEp-2, так же как и обычные фибробласты подвержены цитотоксическому действию дофамина, которое тем сильнее, чем выше концентрация дофамина и чем длительнее культивирование. Определено, что введение в среду метабисульфита не сказывалось на жизнеспособности клеток HEp-2. Морфологическое состояние контрольных и подопытных клеток представлено на рис. 1. Видно, что контрольные клетки через 3 суток посева формируют плотный монослой, составленный из полигональных слегка округлых клеточных тел (рис. 1А). В то же время в процессе взаимодействия с дофамином возрастающей концентрации клетки формируют все более рыхлый монослой, сами они округляются, некоторые клетки сливаются друг с другом (рис. 1Б, В), становится заметным лизис цитоплазмы, выражающийся в неравномерном просветлении обширных ее участков, и, наконец, клетки гибнут (рис. 1Г).
Ультраструктура контрольных и подвергнутых воздействию дофамина клеток HEp-2 представлена на рис. 2. На обзорном снимке (рис. 1А) видно, что отдельные клетки рыхло связаны друг с другом через редкие короткие (можно сказать, точечные) десмосомоподобные контакты (рис. 1Б), основное же межклеточное пространство между ними занято многочисленными микроворсинками (микровиллями). Цитоплазма клеток плотная из-за множества свободных рибосом и крупных вытянутых митохондрий, имеющих темный электронноплотный матрикс. Характерной особенностью контрольных клеток HEp-2 является весьма узкий кортикальный слой, представляющий собой скопление под плазматической мембраной актиновых нитей, располагающихся вдоль ее профиля, а также отсутствие в глубине цитоплазмы протяженных актиновых нитей, свидетельствующее о преимущественно глобулярной форме актина в цитозоле. Это типично для нормальных клеток, выращенных в суспензии, например, для фибробластов, но никак не для распластанных, имеющих мощные пучки актиновых нитей в виде стресс-волокон [14].
Воздействие дофамина существенно изменяет ультратонкую структуру клеток HEp-2. Они округляются, поверхность их сглаживается за счет исчезновения или слияния микровиллей на некоторых участках поверхности, профили ядер становятся извилистыми, внутри цитоплазмы образуются обширные прозрачные лакуны, представляющие собой лизированные области (рис. 3А). Одновременно кортикальный слой существенно расширяется, и непосредственно под ним формируется сеть актиновых нитей (рис. 3Б). Причем часть нитей приобретает центростремительную ориентацию. Такая же довольно плотная и беспорядочная сеть появляется в околоядерной зоне (рис. 3В). Анализ ультраструктурных признаков дальнейшего снижения жизнеспособности клеток под воздействием дофамина показал, что наряду с появлением лизированных участков в цитоплазме формируются четко выраженные муаровые структуры, возникающие из-за нерегулярной конденсации актиновых нитей в одних местах, вызывающей локальные узкоформатные просветления соседних с ними областей, наблюдаемые в сечении в виде светлых полос (рис. 4А). Аналогичный эффект воздействия дофамина наблюдали у фибробластов [7]. Существенно, что у раковых клеток эти процессы формирования лизированных лакун и муарового рисунка сопряжены с появлением здесь же длинных актиновых нитей (рис. 4Б), что предполагает вовлечение вызванной дофамином полимеризации актина в образование указанных повреждений. К1 К2 Л Л МВ ас КС Я Б В ас    ДПК Рис. 3. Ультраструктура клеток HEp-2 после воздействия дофамина. А – обзорный вид, наблюдается повреждение части клеток; Б – гипертрофия кортикального слоя (КС); В – появление сети актиновых нитей в околоядерной области. Л – лизированные локусы; ас – сеть актиновых нитей; остальные обозначения как на рис. 2. Масштаб: А – 5 мкм; Б–В – 0,5 мкм
Выводы Таким образом, проведенное исследование показало, что дофамин оказывает цитотоксический эффект на раковые клетки, и этот эффект обусловлен вызванной прямой полимеризацией цитозольного актина, являющимся терапевтической мишенью этого биогенного амина. Все представленные данные свидетельствуют о том, что использование обнаруженного цитоскелетного механизма взаимодействия дофамина с нейронами оказалось перспективным с точки зрения разработки нового подхода к терапии злокачественного роста и малигнизации в целом. Полученные данные также показывают, что дофамин можно использовать как проникающий молекулярный наноинструмент для выяснения различных аспектов участия актинового цитоскелета в структуре и функции живых клеток разного происхождения, не только злокачественных. Существенно, что такой терапевтический подход к онкотерапии с помощью дофамина избирателен, поскольку только клетки, богатые Г-актином, а к таковым относятся подавляющее количество первичных опухолевых злокачественных клеток, а также все метастазные клетки, чувствительны к дофамину. В то же время, как показано нами ранее, клетки, имеющие хорошо сформированный актиновый цитоскелет в виде стресс-волокон, на построение которых расходуется практически весь пул цитозольного Г-актина, мало чувствительны к дофамину [7]. Список литературы
** Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ, проект № 07-01-00651-а, и Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», Госконтракт № 02.740.11.0301. УДК 004.032.26(06) Нейронные сети | ||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Примерный тематический план В основе курса микроэкономики лежит использование базового экономического подхода, а также поиск методов идентификации затрат и выгод.... | | О двух подходах к пониманию финансового механизма Вместе с тем большинство исследователей пишет о неэффективности практически действующего в России финансового механизма. В некоторых... |
 | Программа дисциплины «Банковское дело» Формирование рыночного механизма в России и необходимость глубоких структурных преобразований в банковской сфере, восстановление... | | General ciРеформирование судебной системы Казахстана: реальность и перспективы Гарантией демократизма государственного механизма служит принцип разделения ветвей власти и их взаимодействия. В связи с этим курс... |
| Программа-минимум подготовки аспирантов и соискателей на кафедре госпитальной терапии Московского факультета гоу впо ргму росздрава для сдачи кандидатского экзамена по специальности 14. 00. 05 «Внутренние болезни» Использование современных технологий в разработке новых диагностических и лечебных методов | | Учебной дисциплины «Финансовые рынки» для направлений 080100. 62 «Экономика», 080200. 62 «Менеджмент» подготовки бакалавра Формирование рыночного механизма в России и необходимость глубоких структурных преобразований в банковской сфере, восстановление... |
| Политические идеи З. Фрейда Фрейд одним из первых широко использовал психологические концепции для интерпретации политических феноменов. Этим он способствовал... | | Метафорические структуры в системах социального взаимодействия Это означает, что и правила смыслообразования, и правила понимания другого совпадают или идентичны по своей структуре, что и становится... |
| Реферат по теории государства и права тема: «Типология государств в рамках формационного подхода и их современная оценка» Тема: Типология государств в рамках формационного подхода и их современная оценка | | Лекция 2 Нервная ткань Нервная ткань состоит из нервных клеток нейронов, способных к возбуждению и проведению нервных импульсов, и нейроглии особых клеток,... |